ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)中每一個步驟都尤為重要，細(xì)節(jié)不容忽視，它是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵與否；為更好的完成實(shí)驗(yàn)，特對高靈敏ELISA試劑盒操作步驟中的忌諱做出以下分析總結(jié)：

　　1、吸取液體時(shí)速度不易太快，以免產(chǎn)生氣泡，吸取的量不夠準(zhǔn)確。

　　2、手工洗板時(shí)每次加入洗滌液后。應(yīng)靜置15～30s，不要將一個酶標(biāo)孑L中的洗滌液濺入另一酶標(biāo)孔中，防止交叉污染。甩去洗滌液后將酶標(biāo)板放在毛巾或吸水紙上拍干。

　　3、底物為TMB，避免與皮膚相接觸。終止液為2tool的濃硫酸具有腐蝕性，應(yīng)盡量避免接觸皮膚。

　　4、加樣后及時(shí)放人孵箱，標(biāo)本較多時(shí)，要分批操作。按說明步驟嚴(yán)格控制操作時(shí)間，防止孵育時(shí)間人為延長，導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍，難以清洗*。

　　5、作時(shí)必須戴手套，穿工作衣，嚴(yán)格健全和執(zhí)行消毒隔離制度。

　　6、剩余樣品及廢棄物應(yīng)經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘，或用5.0g/L次氯酸鈉等消毒劑處理30分鐘后廢棄。

　　7、同批號試劑組分不得混用。

　　8、洗滌時(shí)各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。

　　9、每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。

　　10、要確保微量加樣器的準(zhǔn)確性，可以使用蒸餾水和電子天平進(jìn)行確定(由于蒸餾水不含雜質(zhì)，溫度環(huán)境為20%左右時(shí)，lmL的水可以看作是lg、200 L的水可以看作是0.2g)每一把微量加樣器都應(yīng)該將其最高量程和最低量程進(jìn)行確定。

　　11、在使用微量加樣器時(shí)，吸取不同瓶子中液體后要更換槍頭，即使吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

　　12、檢驗(yàn)技師應(yīng)具備從事實(shí)驗(yàn)室操作的基本素質(zhì)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。能熟練操作實(shí)驗(yàn)儀器、器械，具有一定總結(jié)和分析問題的能力，對實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的意外情況能及時(shí)妥善解決。

　　13、操作前仔細(xì)閱讀說明書，嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行規(guī)范化操作。不同批號的試劑不可混用。值得改進(jìn)的地方，反復(fù)試驗(yàn)確定成立后才能改進(jìn)，比如洗板次數(shù)的掌握等。

　　14、評估試劑的實(shí)用性，試劑的穩(wěn)定與否，對準(zhǔn)確率的高低到頭重要。在試劑啟用前，應(yīng)進(jìn)行陰、陽對照及樣品反復(fù)比照試驗(yàn)，判定試劑符合要求后方可使用。

　　15、加樣要準(zhǔn)確、快速。加樣不準(zhǔn)確，酶生成物的量不能確定，直接影響顯色結(jié)果。另外，顯色的深淺及A值的測定與加入顯色劑和終止液的量有關(guān)，所以加樣應(yīng)慎重。要求在一定時(shí)間內(nèi)加樣完畢的實(shí)驗(yàn)，如果加樣遲緩，便出現(xiàn)誤差，而且試劑長時(shí)間暴露在外，尤其室溫過高時(shí)，保存期會縮短甚至失效。

　　16、使用校對過的微量移液器，排除自然誤差。移液器準(zhǔn)確與否對定量檢測尤為重要

　　17、嚴(yán)格掌握顯色時(shí)間，顯色時(shí)間過短，加入終止液反應(yīng)終止后，底物結(jié)合物的量過少，易出現(xiàn)假陰性。超過顯色要求時(shí)間后顯色，應(yīng)判為假陽性，這可能與試劑本身有關(guān)。加顯色劑后立即顯色，不可報(bào)陽性，這可能是本底顯色的結(jié)果。

　　18、洗滌*，洗板不*，酶結(jié)合物本底顯色會呈現(xiàn)假陽性。另外，洗滌液要新鮮，現(xiàn)用現(xiàn)配，陳舊的洗滌液會出現(xiàn)本底增高現(xiàn)象，也可能出現(xiàn)假陽性。

　　19、嚴(yán)控反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間過長，酶失活；反應(yīng)時(shí)間過短，酶結(jié)合物不能與血清中的微生物抗原抗體充分結(jié)合，生成物結(jié)構(gòu)松散不牢固，容易洗掉，都可能造成假陰性。

　　20、ELISA檢測操作步驟復(fù)雜，可能會影響測定結(jié)果的因素較多，分布在測定操作的各個步驟中，因此必須加強(qiáng)各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，才能得到準(zhǔn)確可靠的檢測結(jié)果。