1.凝膠的預(yù)處理
 

　　交聯(lián)葡聚糖凝膠的市售商品多為干燥顆粒，使用前必須充分溶脹。方法是將欲使用的干凝膠緩慢地傾倒入5～10倍的去離子水中，參照相關(guān)資料中凝膠溶脹所需時(shí)間，進(jìn)行充分浸泡，然后用傾倒法除去表面懸浮的小顆粒，并減壓抽氣排除凝膠懸液中的氣泡，準(zhǔn)備裝柱。在許多情況下，也可采用加熱煮沸方法進(jìn)行凝膠溶脹，此法不僅能加快溶脹速率，而且能除去凝膠中污染的細(xì)菌，同時(shí)排除氣泡。
 

　　2.裝柱
 

　　層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時(shí)，柱床體積應(yīng)為樣品體積的25～100倍。去除鹽及游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長(zhǎng)一些，分離效果好，但柱太長(zhǎng)，則延長(zhǎng)分離時(shí)間，樣品也稀釋過(guò)度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過(guò)細(xì)，會(huì)發(fā)生“器壁效應(yīng)”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對(duì)于除鹽來(lái)說(shuō)應(yīng)為1︰5～1︰25；對(duì)于純化蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)應(yīng)為1︰20～1︰100。
 

　　凝膠柱的裝填方法和要求，基本上與離子交換柱的制備相同。一根理想的凝膠柱要求柱中的填料(凝膠)密度均勻一致，沒(méi)有空隙和氣泡。通常新裝的凝膠柱用適當(dāng)?shù)木彌_溶液平衡后，將帶色的蘭葡聚糖–2000、細(xì)胞色素，或血紅蛋白等物質(zhì)配制成質(zhì)量濃度為2g/L的溶液過(guò)柱，觀察色帶是否均勻下移，以鑒定新裝柱的技術(shù)質(zhì)量是否合格，否則，必須重新裝填。
 

　　3.加樣與洗脫
 

　　(1)加樣量：加樣量與測(cè)定方法和層析柱大小有關(guān)。如果檢測(cè)方法靈敏度高或柱床體積小，加樣量可小；否則，加樣量增大。例如利用凝膠層析分離蛋白質(zhì)時(shí)，若采用28Onm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，對(duì)一根2cm×6Ocm的柱來(lái)說(shuō)，加樣量需5mg左右。一般來(lái)說(shuō)，加樣量越少或加樣體積越小(樣品濃度高)，分辨率越高。通常樣品液的加入量應(yīng)掌握在凝膠床總體積的5%～10%。樣品體積過(guò)大，分離效果不好。
 

　　對(duì)高分辨率的分子篩層析，樣品溶液的體積主要由內(nèi)水體積(Vi)所決定，故高吸水量凝膠如Sephadex G-200，每mL總床體積可加0.3～0.5mg溶質(zhì)，使用體積約為0.O2倍總體積；而低吸水量凝膠如Sephadex G–75，每mL總床體積加溶質(zhì)質(zhì)量為0.2mg，樣品體積為0.Ol倍總體積。
 

　　(2)加樣方法：如同離子交換柱層析一樣，凝膠床經(jīng)平衡后，吸去上層液體，待平衡液下降至床表面時(shí)，關(guān)閉流出口，用滴管加入樣品液，打開(kāi)流出口，使樣品液緩慢滲入凝膠床內(nèi)。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面持平時(shí)，小心加入數(shù)mL洗脫液沖洗管壁。然后繼續(xù)用大量洗脫液洗脫。
 

　　(3)洗脫：加完樣品后，將層析床與洗脫液儲(chǔ)瓶、檢測(cè)儀、分部收集器及記錄儀相連，根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)，預(yù)先估計(jì)好一個(gè)適宜的流速，定量地分部收集流出液，每組分一至數(shù)mL。各組分可用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行定性或定量分析。
 

　　凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液，有時(shí)甚至可用蒸餾水。洗脫時(shí)用于流速控制的裝置最hao的是恒流泵。若無(wú)此裝置，可用控制操作壓的辦法進(jìn)行。樣品體積不宜過(guò)多，最好為床體積的1%～5%，最多不要超過(guò)10%。樣品濃度也不宜過(guò)大，濃度過(guò)大粘度大，分離效果差，一般不超過(guò)4%。
 

　　洗脫液應(yīng)與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會(huì)發(fā)生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強(qiáng)度和pH值。分離血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9～8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液(0.14Mol/L NaCl)。
 

　　凝膠再生和保存
 

　　凝膠層析的載體不會(huì)與被分離的物質(zhì)發(fā)生任何作用，因此凝膠柱在層析分離后稍加平衡即可進(jìn)行下一次的分離操作。但使用多次后，由于床體積變小，流動(dòng)速率降低或雜質(zhì)污染等原因，使分離效果受到影響。此時(shí)對(duì)凝膠柱需進(jìn)行再生處理，其方法是:先用水反復(fù)進(jìn)行逆向沖洗，再用緩沖溶液平衡，即可進(jìn)行下一次分離。
 

　　對(duì)使用過(guò)的凝膠，若短時(shí)間保存，只要反復(fù)洗滌除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，加入適量防腐劑即可；若長(zhǎng)期保存，則需將凝膠從柱中取出，進(jìn)行洗滌、脫水和干燥等處理后，裝瓶保存。