科研實驗中ELISA實驗過程中的常見問題解答

　　ELISA實驗中會遇到很多問題，不是這有點小問題，就是那有點小問題，那該怎么辦呢？以下七點是我們在多年的實驗過程中遇到問題的總結：

　　Q1.標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色

　　溶解標準品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。標準品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復吹打，效率較低、效果也不一定最佳。

　　Q2.標曲和樣本均不顯色

　　在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導致顯色偏弱，推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。

　　Q3.標曲顯色，樣本不顯色

　　當樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度的方法，與不同技術結合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。

　　對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標曲范圍內，得到的數值也更加可信。

　　Q4.標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大

　　這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關了。移液器的使用維護不規范，就會造成移液的誤差較大；實驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。

　　掌握移液器的正確使用和維護。關于個人的操作可練習移液動作、加快速度，確保移液的精密度。

　　Q5.本底偏高，樣本值測不到

　　標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導致無法測到樣本值。

　　在加入TMB顯色后，需實時觀察標曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色，即可終止反應。

　　Q6.樣本經不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異較大

　　有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應該如何稀釋，那么我們就會做下預實驗，確定稀釋倍數。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大，應該選擇哪一個稀釋倍數呢？

　　這里涉及到了基質效應。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質效應較明顯。而經過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當某兩個梯度稀釋后，計算得到的樣本值接近時，我們就可以認為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經過多倍稀釋后，就更加測不到了，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。

　　Q7.不同試劑盒中的組分能否通用

　　除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標準品、標準品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經過優化的，如果貿然使用其它試劑盒的組分，有可能對結果產生影響。