慢病毒載體(Lentiviral vector)較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達(dá)siRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細(xì)胞、干細(xì)胞、受精卵以及分化的后代細(xì)胞中表達(dá)siRNA/miRNA,實(shí)現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達(dá)的功能性沉默，為在原代的人和動(dòng)物細(xì)胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達(dá)降低的動(dòng)物提供了可能性。慢病毒作為siRNA/miRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達(dá)沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢(shì)，為基因功能的研究提供了更強(qiáng)有力的工具。
 

　　慢病毒包裝的原理
 

　　慢病毒(Lentivirus)是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種。構(gòu)建的siRNA / miRNA慢病毒載體，與化學(xué)合成的siRNA 和基于瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建的普通 siRNA 載體相比，一方面可以擴(kuò)增替代瞬時(shí)表達(dá)載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆經(jīng)過(guò)慢病毒包裝系統(tǒng)包裝后，可用于感染依靠傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在感染后可以整合到受感染細(xì)胞的基因組，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)。
 

　　慢病毒包裝的簡(jiǎn)單流程
 

　　1) 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干擾載體的構(gòu)建和質(zhì)粒純化提取。
 

　　2) 慢病毒載體，包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞293T等。
 

　　3) 培養(yǎng) 48hrs - 72hrs 左右，收集含you病毒的上清培養(yǎng)液。
 

　　4) 病毒的純化和濃縮。
 

　　5) 分裝，- 80 ℃保存。
 

　　6) 滴度測(cè)定目的基因檢定，并出具檢測(cè)報(bào)告。
 

　　慢病毒包裝存在的問(wèn)題
 

　　盡管慢載體的研究有了很大進(jìn)展，但距離臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。首先，重組病毒的滴度還不夠高，除Naldini等報(bào)道的結(jié)果外，其余均在101TU/ml~103TU/ml之間，難以達(dá)到體內(nèi)應(yīng)用的需要；其次，由于HIV復(fù)雜的生物學(xué)性質(zhì)，要像目前常用的小鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體那樣建立穩(wěn)定的HIV載體包裝細(xì)胞十分困 難，已建立的包裝細(xì)胞均不理想。據(jù)報(bào)道，Vpr是一種使細(xì)胞進(jìn)入靜止期的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，也是建立包裝細(xì)胞的主要障礙之一。如果確如前文所述，包裝質(zhì)粒中的vpr基因并非必需、去除后不影響載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，則建立穩(wěn)定的包裝細(xì)胞是大有希望的。
 

　　在保證HIV-1載體的安全性上，迄今已做了種種努力，要產(chǎn)生有復(fù)制力的HIV,必須在不同的質(zhì)粒上發(fā)生多次非同源重組事件。即使如此，一旦用于人體試驗(yàn)，仍然不能打消人們對(duì)感染有復(fù)制力的HIV-1的顧慮。更為謹(jǐn)慎的做法是，以非人類的慢病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建載體，如猴免疫缺損病毒(SIV)、豬和牛免疫缺損病毒(FIV和BIV)、馬傳染性貧血病病毒等，而目前這些工作尚屬空白。