細胞培養(yǎng)這個生物學(xué)研究蕞基礎(chǔ)的技術(shù)之一，已經(jīng)滲透進了科研工作的方方面面。本文將與大家分享細胞培養(yǎng)經(jīng)驗的總結(jié)，涵蓋了昆蟲細胞蛋白表達常用到的sf9細胞與哺乳動物細胞蛋白表達系統(tǒng)的CHO細胞與HEK293細胞，主要介紹了細胞復(fù)蘇、細胞傳代、細胞凍存的具體操作方法。

細胞復(fù)蘇：
1、細胞培養(yǎng)條件
2、復(fù)蘇流程：
（1）確認水浴鍋的水清潔可用，方可提前打開37度預(yù)熱。
（2）確認好復(fù)蘇細胞的液氮罐中具體位置，并做好復(fù)蘇登記。
（3）提前做好復(fù)蘇準(zhǔn)備，預(yù)熱培養(yǎng)基。
（4）懸浮和貼壁細胞復(fù)蘇參數(shù)：
（5）將細胞快速放入37度水浴鍋中迅速溶解，1.8 ml時間大概1分30秒，1 ml大概1 min左右，需計時，期間不要老是拿起來觀察，需要快速復(fù)溶，避免細胞受到損傷。
（6） 貼壁細胞需離心， 1000 rpm，5 min；懸浮細胞直接加入預(yù)熱的培養(yǎng)基中然后放入培養(yǎng)箱中
（7）貼壁細胞離心后去除上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基重懸細胞后加入到T25方瓶，蕞后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（8）取小樣計數(shù)觀察，細胞活力在70%以上算正常。低于70%活力可能細胞狀態(tài)不太好，需要培養(yǎng)和恢復(fù)。

細胞傳代培養(yǎng)
1． 懸浮細胞傳代流程：
（1） 先將裝有細胞的搖瓶從培養(yǎng)箱拿出，用酒精噴灑瓶身后將搖瓶拿進超凈臺；
（2） 打開搖瓶瓶蓋，用200 ul移液器取100~200 ul細胞放入1.5 mlEP管中，瓶蓋過火，擰緊，將培養(yǎng)瓶放回搖床；
（3）將200 ul細胞混勻，取10 ul細胞加入10 ul臺盼藍，顯微鏡下計數(shù)。根據(jù)細胞數(shù)決定下游實驗；
（4）細胞需計數(shù)兩次求平均值；
（5）懸浮細胞生長參數(shù)
（6）根據(jù)不同細胞的生長曲線在合適的時間和密度給細胞接種傳代；

以sf9細胞為例：
細胞接種密度0.4 x10^6個/ml,24 h密度1x10^6個/ml,48 h密度2.4x10^6個/ml,72 h密度6x10^6個/ml，此時需要傳代細胞；要求留樣100 ml0.4 x10^6個/ml具體操作如下：
計算：需要母細胞體積=100*0.4/6=6.6ml
需要培養(yǎng)基體積=100-6.6=93.4ml
將上面體積的細胞和培養(yǎng)基加入到搖瓶中，放回27度培養(yǎng)箱培養(yǎng)即可

2. 貼壁細胞傳代流程：
（1） 顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)和密度，80%匯合率以上需要傳代；
（2） T25方瓶中加入0.5 ml~1 ml 0.25%胰酶溶液（需37度預(yù)熱），使瓶底細胞都浸入溶液中。放入37度培養(yǎng)箱進行消化；
（3） 不同細胞消化時間不一樣，初次培養(yǎng)貼壁細胞消化時間可以定在1min,顯微鏡下觀察消化結(jié)果，消化不*可以再適度加長消化時間；
（4）對于有經(jīng)驗的細胞消化可以定個準(zhǔn)確的時間，消化結(jié)束后將培養(yǎng)皿放入顯微鏡下觀察細胞，隨著時間變長，原先貼壁細胞逐漸變圓，慢慢脫落，在還未飄起時棄掉胰酶，加入含有10%FBS的新鮮培養(yǎng)基終止消化；
（5） 用1 ml移液器輕輕吹打細胞，將細胞全部吹下后，可進行傳代，一般是1：3傳代；
（6） 貼壁不牢的細胞可以用0.1%的凝膠包被4℃ 30min,用PBS清洗5次。

細胞凍存
1、細胞凍存參數(shù)

2、貼壁細胞凍存流程：
（1）將胰酶、培養(yǎng)基提前37度預(yù)熱；凍存液提前配好放到4度冰箱預(yù)冷；
（2）先將裝有細胞的方瓶從培養(yǎng)箱拿出，用酒精噴灑瓶身后將搖瓶拿進超凈臺；
（3） 打開方瓶瓶蓋，將方瓶中的培養(yǎng)基倒干凈；
（4） 根據(jù)細胞消化難易程度添加適量的胰酶；T25方瓶加1 ml胰酶,T75方瓶加2ml胰酶；
（5） 根據(jù)細胞消化難易程度放入37度培養(yǎng)箱消化1-5 min，知道看見大片的細胞開始脫落，要及時終止消化；
（6） 終止培養(yǎng)基需要含有至少10%血清，通常終止比例為1:10（1ml胰酶需要加入10 ml終止培養(yǎng)基），對胰酶比較敏感的細胞需要終止后離心后換新鮮的培養(yǎng)基；
（7） 終止后將細胞輕輕吹打混勻，避免結(jié)團，細胞收集到15 ml或者50 ml離心管中，將離心管配平，放入離心機中1000 rmp5分鐘；
（8） 將離心管從離心機中取出，用酒精噴灑后拿進超凈臺；
（9） 棄掉離心管中上清，加入預(yù)冷的凍存液，吹打混勻；
（10） 將混勻的細胞加入凍存管中；
（11）將凍存管放入凍存盒中，蕞后放入-80°冰箱；
（12） 第二天把細胞轉(zhuǎn)移至液氮；

3、懸浮細胞凍存流程：
（1） 先將裝有細胞的搖瓶從培養(yǎng)箱拿出，用酒精噴灑瓶身后將搖瓶拿進超凈臺；
（2） 打開搖瓶瓶蓋，取適量細胞放入50 ml離心管或15 ml離心管中；
（3） 將離心管配平，放入離心機中1000 rmp5分鐘；
（4） 將離心管從離心機中取出，用酒精噴灑后拿進超凈臺；
（5） 棄掉離心管中上清，加入提前預(yù)冷的凍存液，吹打混勻；
（6） 將混勻的細胞加入凍存管中；
（7） 將凍存管放入凍存盒中，蕞后放入-80°冰箱；
（8） 第二天把細胞轉(zhuǎn)移至液氮；